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細胞Transwell檢測技術服務

簡要描述:細胞Transwell檢測技術服務是達為科生物的基礎服務項目之一,由細胞平臺經驗豐富的實驗人員操作完成。

  • 更新時間:2022-12-22
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詳細介紹

細胞遷移運動普遍存在于組織發育、傷口愈合、血管發生等許多正常的生理過程中, 同時又存在于像腫瘤發生這樣的病理過程中。很多情況下,細胞遷移運動并不是隨機和無目的的, 而是受到趨化因子的觸發和誘導,在趨化因子出現后, 它通過與細胞表面受體的相互作用,誘導出各種細胞內的應答,如細胞極化產生、骨架重排、小泡運輸加快等, 這些應答反應終協助細胞完成遷移運動。

細胞遷移運動過程主要包含以下四個循環步驟: ①在細胞遷移的前導端, 局部細胞膜出現前伸而形成偽足; ②偽足通過黏附結構黏附到基底; ③細胞骨架收縮, 引起細胞位置的整體易位; ④尾端脫黏附及回縮。通過以上步驟循環進行, 細胞將一步步向目的地前行。細胞黏附、遷移和極化的保持等過程都依賴于整合素的靶向作用及其所包含黏附位點的重組動力, 也即在細胞前端的胞吐作用能夠為細胞提供新的黏附受體來輔助細胞遷移,同時這些運動的受體在細胞的尾部通過胞吞內化, 故由此形成以胞吞和胞吐為調節方式的整合素循環。

腫瘤細胞骨架發育缺陷和黏附分子表達異常必然引起其運動遷移行為發生改變,其中比較明顯的變化涉及三個方面: ①細胞連結普遍削弱, 導致以細胞間連結發達的上皮類組織細胞突變轉化后出現細胞隨機遷徙, 引起組織解體的現象; ②細胞與基底黏附失調,由于整合素表達與基質金屬蛋白酶分泌異常,導致細胞黏附不穩和脫黏附現象;③腫瘤細胞普遍軟化(剛度大約比正常細胞低4倍), 使其黏附的基質環境硬度相對增大, 導致細胞內張力增加, 從而有利其遷移運動。腫瘤細胞的遷移運動行為并未脫離正常組織細胞的基本模式,但與正常組織細胞通過調動遷移行為參與組織重建相反, 腫瘤細胞非時、非地及失控的遷移運動將對組織結構穩定性維持產生負面影響。

細胞遷移過程中, 諸如遷移速率、遷移效率以及細胞取向和定位等運動特性均與細胞的結構功能狀態密切相關, 腫瘤細胞因其骨架活動和信號轉導異常, 雖然遷移速率明顯高于正常細胞, 但因遷移的方向頻繁發生改變呈原位“翻滾”, 其遷移路程較長而實際位移很短, 故遷移效率遠低于正常細胞。同時, 胞外基質的物理特性對細胞遷移行為也有顯著影響, 正常細胞能夠感應胞外的物理信號, 并相應調整其遷移行為, 如在不同硬度和微觀結構的基底上, 正常細胞的遷移速率和遷移方向會隨之變化, 細胞始終如一地向硬度增加的方向遷移。而腫瘤細胞則顯得比較“遲鈍”, 胞外基質的物理特性改變似乎對它們沒有影響或影響很小。正是由于腫瘤細胞喪失位置信息的識別能力, 相對正常細胞高效及定位和取向明確等遷移運動特征, 腫瘤細胞遷移軌跡離散、相鄰細胞運動協同性差, 終導致群體細胞呈無序堆積。

研究腫瘤細胞遷移常用的是transwell遷移實驗。transwell小室其外形為一個科放置在孔板里的小杯子,底層有一張通透性的膜,這層膜有微孔,孔徑大小有0.1到12μm,根據不同的需求有不同的材料,常用的是聚碳酸酯膜。在腫瘤細胞遷移實驗中常用8μm或12μm的膜,上室種腫瘤細胞,下室加入FBS或其他特定的趨化因子,腫瘤細胞會向營養成分高的下室遷移,計數進入下室的細胞可以反映腫瘤細胞的遷移能力。

Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分,含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖,鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上,能在DMEM培養基中重建形成膜結構,這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。濾膜孔徑一般為8um,而且膜孔都被Matrigel覆蓋,細胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜,這與體內情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間,鋪有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趨化劑,上室加入重懸的瘤細胞,具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。細胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關,選擇 25ugMartrigell鋪膜,16小時后觀察結果較為合適。穿過濾膜的細胞多數粘附在濾膜下表面,可用棉簽將上表面的細胞拭去,然后用乙醇固定濾膜,PE染色,在光鏡下觀察統計穿過Martrigel的細胞數。另外用Transwell小室也可進行重建基質膜侵襲分析,這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel,加入細胞72h后觀察結果。值得注意的是,細胞在Transwell腔中培養 72小時后,有相當數量穿過濾膜的細胞不再粘附在濾膜下表面,而是脫落進人下腔溶液中.因此統計穿過基質膜的細胞數目時應把這部分細胞考慮在內。腫瘤細胞穿過重建基質膜的能力與它的體內侵襲轉移能力表現出較好的相關性,可以用重建基質膜模型初篩抗侵襲藥物。

腫瘤細胞侵襲實驗(Tumour InvasionAssay)可以:(1)研究各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響;(2)一些抑制血管生成的新藥研究;(3)研究腫瘤細胞侵襲和轉移機制。

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