一、技術原理與核心突破

CRISPR/Cas9系統源于細菌適應性免疫機制，通過雙RNA引導實現靶向DNA切割：

1. 引導機制：

• crRNA（CRISPR RNA）識別靶序列，tracrRNA（反式激活crRNA）激活Cas9酶，兩者可融合為sgRNA（單鏈引導RNA）。

• PAM序列（5'-NGG-3'）是Cas9切割的必要位點，位于靶基因下游。

2. 切割模式：

• Cas9的HNH結構域切割互補鏈，RuvC-like結構域切割非互補鏈，形成雙鏈斷裂（DSB）。

3. 修復路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：易產生插入/缺失突變（Indels），導致基因敲除。

• 同源定向修復（HDR） ：需提供同源修復模板（ssODN或載體），實現精準插入或點突變。

革命性突破：CRISPR/Cas9shou次實現哺乳動物細胞的高效、可編程基因編輯，且支持多靶點同步編輯。

二、動物模型構建策略與技術優化

（一）核心操作流程

（二）關鍵技術參數

（三）模型類型與構建效率

三、疾病模型應用與前沿案例

（一）腫瘤模型

1. 肝癌：

• 同步靶向肝細胞抑癌基因 PTEN 和 P53，8周內誘發肝癌。

2. 腦瘤：

• 多基因編輯（Ptch1/Trp53/Pten/Nf1）構建成神經管細胞瘤模型。

3. 肺癌：

• 組織特異性模型：條件性Cas9小鼠 + AAV9遞送sgRNA（靶向Kras/p53/Lkb1），實現肺組織特異性致癌。

（二）遺傳病模型

（三）神經與代謝疾病

• 阿爾茨海默病：

• MAPT突變模型：CRISPR/Cas9編輯小鼠tau蛋白基因，模擬神經纖維纏結。

• 糖尿病：

• db/db小鼠改良：CRISPR精準引入Lepr突變，縮短模型構建周期至12周。